VIII. Les expérimentations 2019-2020 sur la culture des morilles

Cet article aborde ma campagne expérimentale 2019-2020 de culture des morilles.

Tout d'abord, un résumé de l'année précédente : j'ai obtenu une quinzaine d'ascocarpes de Morchella elata en bordure de cartons enterrés, entre mi-mars et début avril (2019), ces cartons ayant été ensemencés à leur surface par du mycélium de morille probablement monosporal (monocaryotique), amplifié sur blé et dispersé vers la Toussaint de l'année précédente (2018). La mise en place d'une bâche étanche (dans le but de maintenir l'humidité de surface) sur les lieux d'ensemencement pendant l'hiver n'a pas paru être un critère fondamental pour la réussite de la méthode. L'hiver 2018-2019 n'a pas comporté de vague de froid notable. Le mycélium était encore partiellement visible sur des fragments de cartons découverts par bêchage du jardin à l'automne 2019, témoignant de sa possible survie en été. 

Revenons au printemps 2019. Je décide de tenter le bouturage de morceaux d'ascocarpes frais issus de la campagne de culture 2018-2019 (chapeau et pieds) sur gélose, plutôt que de partir de fragments de morilles séchées. J'ai en tête les images de mycélium de morille issues du livre de Stamets que j'ai eu comme cadeau à noël et des diverses références bibliographiques : croissance fulgurante, mycélium plat, formation de sclérotes encroûtants sur gélose et roussissement après quelques semaines. Tout le contraire du mycélium cultivé l'année d'avant (couleur crème, croissance plutôt lente, duveteux, formation tardive de sclérotes isolés). Ces deux classes de mycélium ont été décrites par Buscot et Sehgal et je soupçonne le mycélium plat d'être dicaryotique et le duveteux monocaryotique (bien qu'aucun de ces auteurs ne soit ni définitif ni même totalement clair sur ce point). J'ai donc envie de tenter d'isoler le phénotype plat à croissance rapide pour mes essais de culture. Pour resituer le contexte intellectuel, lors de l’isolement de la souche, je suis en pleine phase de bibliographie. Je suis précisément en train de lire la thèse de Buscot que j'ai mis plus d'un mois à dénicher via ma bibliothèque universitaire, F. Buscot (très cordial au demeurant) ne disposant plus lui-même que de son exemplaire personnel et de microfiches.

Le milieu gélosé est le même que l'année précédente avec quelques variations : jus de pomme dilué pour les sucres, agar-agar, sauce nuoc-mâm pour les protéines et sels minéraux (à place de la sauce soja, je n'avais plus la marque que je voulais), neutralisation jusqu'à pH 7 avec du bicarbonate de sodium alimentaire (car soluble, facile à doser) puis ajout d'un excès de carbonate de calcium en poudre. Stérilisation directement en boites de pétri au moins 60 minutes puis ensemencement avec des fragments de pieds ou de chapeau de morilles fraîches (et locales, issues de la culture 2018-2019 comme évoqué en début d'article) sous bec bunsen comme décrit dans le chapitre précédent. Les morceaux de morilles ne sont pas eux-mêmes stériles mais le mycélium pousse plus vite que n'importe quel contaminant. Je n'utilise pas de chloramphénicol dans mes milieux de culture pour deux raisons : premièrement c'est un inhibiteur de bactéries et les bactéries ne posent aucun problème sur ce genre de milieu de culture très pauvre en azote, deuxièmement j'ai toujours considéré les antibiotiques comme le palliatif d'un travail de cochon, un vrai microbiologiste capitalise sur ses erreurs de stérilisation pour les corriger. 

La reprise du mycélium est en général très rapide (24 à 48 heures). J'ai observé des cultures sectorisées sur fragments de chapeau, ce qui implique que les chapeaux contenaient des spores (voir Buscot) et que les ascocarpes étaient donc probablement issus d'un mycélium dicaryotique. Comme les ensemencements de l'automne précédent étaient probablement issus d'une culture monosporale (et donc monocaryotique), cela implique que papa ou maman mycélium était déjà présent dans le sol avant mes mises en place (vous suivez : papa, maman, spores, je ne vous fais pas un dessin, voyez plutôt la bibliographie). Bref. Les morceaux de pied ont donné lieu à une culture de mycélium non sectorisée, quant à elle forcément dicaryotique puisque issue d'un ascocarpe dont le chapeau contenait des spores. Vous suivez toujours ?

Comment reconnaître un mycélium de morille ? Il colore précocement la gélose de culture en violet-marron avant même de roussir. J'ai cru à un contaminant bactérien type pseudomonas avant de confirmer ce trait cultural avec plusieurs références bibliographiques. Parmi les différentes cultures, toutes ont une croissance rapide à très rapide (de 1 à 4 cm par jour à 15°C, ce qui surpasse tout type de fungi), et toutes présentent deux phénotypes : ras et discret à croissance rapide ou cotonneux à croissance (relativement) lente. Les hyphes présentent de nombreuses anastomoses en culture, ce qui semble un autre trait particulier du mycélium de morille. Bien sûr, pas de conidies en boîte de pétri (milieu trop humide). Le phénotype cotonneux est plus courant dans mes cultures que le phénotype ras.

Comment reconnaître un bon mycélium de morille ? Le phénotype ras à croissance rapide (et formation de sclérotes précoces et encroûtants) est pour moi synonyme de mycélium dicaryotique et capable de fructifier, dans la mesure où toutes les données de la littérature convergent vers ce phénotype. J'ai donc isolé le plus beau mycélium obtenu : celui issu du bouturage de tissu d'un pied d'ascocarpe. Je ne le sais pas encore au printemps 2019, mais ceci sera fatal à la récolte 2020 (admirez au passage le cliffhanger). Ce mycélium présentait une croissance fulgurante, une coloration franche et précoce du milieu de culture, un roussissement marqué après deux semaines de culture sur gélose aux pommes et finalement la constitution d'une plaque de sclérotes encroûtant précoces. Sauf qu'on est en avril et que la suite est fin août, j'ai donc dû laissé ce mycélium en attente dans sa boîte de pétri à la cave (15-22°C) dans l'obscurité et au calme (dans un carton), après un simple repiquage de précaution pour le séparer des contaminants de sa boîte de pétri d'origine. Stockage au réfrigérateur trop risqué chez moi à cause de la condensation et des courants d'air éventuels. Et puis bon, stocker des souches de champignon au milieu des yaourts, c'est quand même aussi un peu crade.

Retour fin août, c'est avec appréhension et sans y croire que je transfère un petit morceau de gélose issu de cette boite de pétri sur pain stérilisé : ça reprend avec la même vigueur qu'au printemps même après 4 mois de stockage à température ambiante. Ouf. Le mycélium est toujours coloré mais pas de sclérotes sur pain : contrairement à Molliard je trouve ce milieu finalement assez moyen, trop dense, trop acidifiable, mauvaise tenue à la stérilisation. Je prépare donc un bon milieu d'amplification à base de grains de blé frais enrichis au calcium. Même recette que l'année dernière : blé à poules premier prix trempé dans de l'eau 24 heures, bien égoutté et mélangé à une poignée de plâtre ou de cendre (pas vu de différence sur la croissance même si la cendre a un pouvoir tampon que le plâtre n'a pas) pour un seau de blé regonflé, puis stérilisation au moins une heure à la cocotte minute en bocaux ou en sacs de cuisson. L'ajout de paille broyée est un plus évitant la formation d'une pâte immonde en fond de bocal si le blé n'est pas assez égoutté. On vise un milieu plutôt sec malgré tout. L'inoculation est assurée par des cubes de 5 mm de gélose découpés en boîte de pétri puis déposés stérilement sous flamme à la surface des grains de blé. J'utilise pour la découpe un scalpel que je chauffe au rouge entre chaque prélèvement. La reprise se fait en 24-48 heures. La colonisation est incroyablement rapide, plusieurs cm par jour. On n'oubliera bien sûr pas de laisser le couvercle des bocaux dévissé d'un bon quart de tour pour permettre au mycélium de respirer.

Ce que j'ai noté concernant la croissance du mycélium (à partir d'une même culture de départ) : en août et septembre la formation de sclérotes sur blé avorte en poches de liquide rougeâtre. En octobre (dès fin septembre en fait) la formation de sclérotes est remarquable, toutes conditions de culture identiques par ailleurs (20°C, blé stérilisé, noir complet, mycélium issu de la même boite de pétri). La formation des sclérotes est donc particulièrement favorable au mois d'octobre avec ma souche de morille. Les expérimentations 2018-2019 montrent de plus que la fenêtre optimale de formation des sclérotes s'étend à peu près jusque mi-novembre. Les sclérotes sont de type (très) précoce et (très) encroûtant. La totalité d'un bocal de blé est colonisée en moins d'une semaine et convertie en sclérotes en 3 semaines. Les sclérotes apparaissent exclusivement sur les parois en verre des bocaux de culture (jamais au milieu des grains de blé) et dans un ordre chronologique suivant strictement l'ancienneté du mycélium, avant même la colonisation totale du milieu. Détail amusant : dans un des bocaux, après quelques jours de croissance, j'ai accidentellement déplacé le morceau de gélose d'inoculation. La formation des sclérotes a quand même débuté autour de la gélose, même déplacée, dans une zone quasiment pas colonisée par le mycélium. Je confirme donc que les sclérotes se forment dès que le mycélium a localement atteint un certain âge (quelques jours pour des sclérotes encroûtant), d'abord proche du point d'inoculation, dans une zone exempte de nutriments et avant même que le mycélium ait colonisé l'ensemble du milieu de culture. Les morceaux de gélose ayant été placés à la surface du blé stérilisé (milieu riche), le mycélium s'est débrouillé tout seul pour sonder son milieu de culture et trouver les zones pauvres (parois du bocal) pour y transférer son carbone. Je persiste donc à penser que la pauvreté locale du milieu en nutriments est le facteur clef déterminant le lieu d'apparition des sclérotes plutôt que le fait que le mycélium rencontre une barrière physique. Les sclérotes se formant également massivement sur la paroi en verre au dessus de la surface libre des grains de blé (voire sous le couvercle), difficile d'invoquer l'effet d'une barrière physique dans la mesure où le mycélium est ici peu confiné par le support. Tout support solide non nutritif et humide sera donc un lieu de formation privilégié des sclérotes.

En tout je n'ai donc procédé qu'à deux repiquages en boite de pétri (purification) et un repiquage en bocal (amplification). Les bocaux ainsi inoculés (2-3 semaines) ont servi a ensemencé de la terre de jardin entre septembre et octobre. J'ai appliqué ma règle d'or : inoculum et source de carbone séparés dans la terre mais "en même temps" (©LaREM) au contact l'un de l"autre. J'ai tenté la recette chinoise et d'autres variations autour de l'idée de déphaser géographiquement ou temporellement inoculum et source de carbone. La plupart des places a montré une bonne reprise de croissance en surface ainsi que la présence de Costantinella cristata Matruchot à partir de fin novembre dans les endroits abrités de la pluie et du soleil direct. La forme conidienne de morille a disparu en janvier lors des quelques rares gelées. L'hiver a été très pluvieux et doux, le printemps (météorologique) très précoce et notamment chaud et sec dés début mars (la sécheresse totale en mars est assez typique de ma station), obligeant à humidifier quotidiennement (mais sans excès, pas question de noyer le sol) les places inoculées de manière à maintenir une humidité résiduelle de la terre en surface. A la mi mars quelques faibles signes de mycélium (Costantinella cristata) réapparaissent en surface, on sent que ça pousse... puis plus rien.

Le confinement du printemps 2019 ayant été propice aux observations, j'ai largement eu le temps de constater que la culture des morilles version 2019-2020 a été un échec total. Pourtant c'était bien parti : mycélium parfait et automne diluvien. La fin d'hiver a certes été exécrable dans la nature à cause du manque d'humidité mais ce n'est pas le problème ici car je pouvais arroser le sol. Deux possibilités : soit le mycélium est resté en attente dans le sol à cause de la chaleur diurne et de l'air sec, soit il a tout bonnement disparu. L'année précédente, j'avais noté des proto-morilles sous bâche même sur les zones n'ayant rien donné. Cette année rien de rien. J'ai donc mis un coup de pelle dans chacune des parcelles ensemencées : il ne reste pratiquement rien du mycélium mis en place, ni dans les cartons, ni dans la terre, même les sclérotes enterrés à l'automne ont presque totalement disparu. Tout au plus peut-on repérer quelques structures rhizomorphiques sur la dernière place inoculée mi-octobre. L'inoculum n'a pas passé l'hiver, en tout cas pas dans l'état de pouvoir fructifier. Sur les 15 kg de mycélium que j'ai utilisé et distribué autour de moi, seuls deux ascocarpes minuscules sont sortis dans une station similaire à la mienne, sur substrat de cartons et dans un sol pauvre de gravats calcaires rapportés (pas chez moi donc), le problème était donc bien la faible capacité à fructifier de cette souche. Si mes calculs sont bons (une morille pèse en moyenne 15 g), le rendement massique serait donc d'à peu près 0.2% cette année, pas de quoi crier victoire.

Comment peut-on partir d'un mycélium bien sous tous rapports et faire un bide presque complet ? J'exclue la méthode de mise en place que j'estime être la bonne. J'exclue mon critère de sélection d'un mycélium probablement dicaryotique qui a montré toute sa pertinence vu la formation exubérante de sclérotes sur blé et la bonne reprise dans le sol. Il reste donc trois paramètres, mais qui se rejoignent finalement : le mycélium isolé était issu du bouturage d'un fragment d'ascocarpe (trop vieux), j'ai planté tôt en saison (trop chaud), et j'ai conservé le mycélium plusieurs mois à température ambiante (trop chaud). Le mycélium était donc largement à plus d'un an et demi d'existence (et deux phases de formation de sclérotes) au printemps 2020 et il entamerait donc son deuxième cycle de fructification, ayant passé l'été à des températures supérieures à 20°C, ce qui contrevient à toutes les règles vues dans la bibliographie concernant le vieillissement du mycélium (l’expérience est donc malheureusement cohérente avec la littérature...). Ma conclusion est que le mycélium est arrivé en phase de sénescence durant l'automne. Une confirmation : en janvier, j'ai effectué des prélèvements de Costantinella Cristata Matruchot sur les places inoculées. Au microscope, il ne restait plus que des parois cellulaires vides de toute substance. J'ai donc sélectionné (et mal conservé, voir article suivant) un beau mycélium en fin de vie. Il est même surprenant que la croissance ait été encore si vigoureuse en octobre vu l'âge du mycélium. Je pense également avoir planté à une époque où la concurrence est trop forte dans le sol, vu que le seul résultat obtenu (deux ascocarpes microscopiques) l'a été sur une plantation tardive (fin octobre). J'ai largement sous estimé le caractère psychrophile du mycélium.

Conclusion : la jeunesse du mycélium est un paramètre d'ordre un pour la réussite de la culture. Le bouturage (clonage) de pieds d'ascocarpes, même s'il garantit quasiment le fait d'obtenir une souche dicaryotique, n'est à mon avis pas une voie de propagation fiable pour la culture des morilles. Il vaut mieux un mycélium jeune et douteux issus de spores (campagne 2018-2019) qu'un beau mycélium âgé issu du bouturage d'un ascocarpe (campagne 2019-2020) - je me garderais de toute métaphore douteuse. Il est périlleux de juger le potentiel final de fructification d'une souche pure de morille à partir de son phénotype sans connaître son historique. Idéalement, il faudrait isoler un mycélium issu de spores séchées d'une sporée par exemple (dont la conservation est excellente, voir Buscot) le plus tard possible, en fin d'été par exemple, et chercher un phénotype ras à croissance rapide pour l'amplification. Malgré tout, plus les saisons passent, plus je doute de l'intérêt de passer par des cultures pures et stériles. Le manque de diversité génétique et le statut caryotypique incertain d'une culture pure issue de spores et amplifiée stérilement fait courir un risque important d'échec au moindre aléa climatique ou génétique en plus d'avoir un coût non négligeable. Et faut pas se mentir, la sélection et l'amplification de souches est quand même assez chronophage et technique, surtout quand ça fructifie pas. Résultat des courses : j'ai perdu ma souche locale...

Laissons donc passer tranquillement l'été en attendant d'avoir des idées neuves de protocoles expérimentaux. J'ai par exemple comme idée de cultiver, ni vu, ni connu, les bonnes souches chinoises vendues en supermarché, séchées (à partir de leur spores il va sans dire) et de repartir de méthodes culturales non stériles et non monoclonales, comme préconisé dans cet excellent blog dont j'ai déjà parlé (edit 2024: n'existe plus, c'est une copie). On rappelle qu'une morille contenant à peu près 300 millions de spores, une approche plus darwiniste de la culture des morilles doit donc pouvoir être tentée. Je verrai bien vers où l'inspiration (et surtout le manque de temps libre) me portera. Je ferai certainement entre temps un article sur le livre de Zhu Douxi que je vais récupérer d'ici quelque temps (il est déjà livré en Chine, ça m'a coûté un bras, mais je dois encore le faire rapatrier en France, et c'est pas gagné en ce moment vu que la poste chinoise est fermée aux particuliers pour cause de COVID-19). J'espère y trouver des clefs sur la sélection des souches en Chine. En tout cas le pitch fait envie : "The book is divided into six parts, mainly on the biological characteristics, ecological environment, physiological mysteries, growth conditions, nutrients, strain separation, mother seed production, original seed production, cultivated species production, cultivation methods, management techniques of morel, A complete set of core technologies, such as nutrition bag making, pest control, harvesting and processing, and edible methods, were discussed in detail. It is the first perfect hardcover book with advanced cultivation technology of morel in China. Readers will get satisfactory results as long as they follow the core technology in the book, combined with local climatic conditions and actual conditions." Si avec ça on devient pas millionnaires grâce à Mr Zhu...

Pour les schémas et illustrations c'est par ici : les expérimentations 2019-2020 sur la culture des morilles.

Un time-lapse maison montrant le mycélium de morille 2019-2020 partant à l'assaut d'un bocal de blé stérile, entre septembre et octobre 2019 : Animation de 3 semaines de colonisation. Attention, fichier de 70 Mo pouvant mettre un certain temps à charger.

Ce fringant mycélium de morille du clade Elata ne le sait pas encore mais il est à quelques mois d'une mort horrible par sénescence qui torpillera les tentatives de culture 2019-2020. Crédit  : Raphaël BOICHOT

Prochain article : la culture des morilles sous serre selon Zhu Douxi himself