X. L'isolement du mycélium de morilles pour les nuls

Cet article permet d'apprendre à isoler du mycélium de morilles avec du matériel de cuisine, mais dans sa cave.

La procédure d'isolement du mycélium de morille étant à peu près toujours identique, je propose ici un petit tutoriel en images, court mais efficace, permettant de réaliser cette opération sans avoir de connaissances pointues en microbiologie, ni de matériel particulier (comme une hotte à flux laminaire ou une boîte à gants). La méthode présentée ici est presque réalisable entièrement avec du matériel de cuisine classique. Un roman-photo résumant l'ensemble des étapes est disponible à la fin de l'article. J'en profiterai pour comparer la croissance sur deux milieux de culture opposés : un milieu semi-synthétique riche en sucres et un milieu indéfini pauvre en sucres.

Matériel nécessaire (on trouve tout dans sa cuisine et sur internet) : 

- Agar-agar de cuisine, glucose déshydraté, pommes de terre.

- Autocuiseur (cocotte-minute) avec panier, casserole dédiée à la cuisson des milieux de culture, boîtes de pétri en verre ou petits bocaux à vis (type féta ou pot pour bébé) ou tubes de culture, bec Bunsen portatif (type Labogaz de Campingaz) ou fixe relié à un détendeur, ciseaux (type chirurgie) et brucelles stérilisables, scalpel, entonnoir, filtres à café, balance précise à 0.1 g.

- Des morilles séchées conservées dans des bonnes conditions.

- Une pièce non ventilée, fraîche et sombre, cave idéalement.

Matériel facultatif (on peut réussir sans, mais c'est mieux avec) : 

- Microscope optique allant jusqu'au X100, voire idéalement X1000. J'ai trouvé le mien en braderie pour 70 euros. 

- De la bonne terre de jardin et cendre de cheminée, un coin à l'extérieur.

- Carbonate de calcium.

- Masque chirurgical (oui oui, le fameux truc qui ne sert à rien).

- Réfrigérateur dédié afin de garder une relation conjugale harmonieuse.

Ce tutoriel va présenter l'isolement de mycélium de morille à partir de fragments de morilles séchées. L'intérêt de repartir de morilles séchées est que le mycélium est forcément issu de la germination de spores et est donc génétiquement jeune. De plus cette méthode peut être démarrée à n'importe quelle saison, afin d'éviter les problèmes de vieillissement du mycélium lié au stockage estival. L'inconvénient est que le mycélium obtenu ne sera pas un clone exact de l'ascocarpe récolté. Les morilles séchées sont de plus faciles à échanger et traversent le temps et les barrières douanières sans encombre. Il va sans dire que la méthode fonctionne aussi avec des fragments d'ascocarpes frais dans le cas où un clonage est souhaité (On prendra alors plutôt des fragments de pieds). D'expérience, je trouve les fragments de morilles séchées paradoxalement moins contaminés.

Il est toujours utile de savoir si la morille que l'on veut utiliser pour la production de mycélium est stérile ou pas. Une première observation peut être faite au microscope optique : on broie un fragment d'hyménium dans un peu d'eau entre une lame et une lamelle de microscope pour voir si les asques contiennent des spores. Au grossissement x100, les chapelets d'asques contenant 8 spores sont faciles à identifier parmi les contaminants éventuels. Si la présence de spores est avérée, on peut tenter de les faire germer. A cet effet on broie de nouveau un petit morceau d'hyménium dans un peu d'eau sucrée (typiquement eau + miel 1%) et on laisse incuber 24 heures à température ambiante. Ceci peut être effectué directement sur une lame de microscope. Pour que le mélange eau + miel ne s'évapore pas, on enferme la lame dans une boîte étanche contenant un fond d'eau. Au bout de 24 heures, on doit observer un mélange de spores non germées et certaines spores dont le mycélium atteint déjà une taille sortant du champs optique du microscope. 

Si la germination des spores est avérée, on conserve soigneusement notre morille séchée à l'abri de la lumière et dans un endroit frais et sec : les spores sont revivifiables plusieurs années stockées correctement.

Le mycélium de morille est plutôt facile à isoler pour une raison simple : sur milieu adapté, il pousse largement plus vite que n'importe quel contaminant, hormis Rhizopus stolonifer, qui en plus de lui ressembler à l'état jeune, peut coloniser un milieu de culture plus rapidement. Les pénicilliums et autres aspergillus spp. sont très simples à discriminer. Les bactéries font acte de présence seulement en cas de milieu de culture mal préparé (eau liquide résiduelle), le chloramphénicol est donc pour moi tout à fait superflu. Sur culture en pétri de morceaux d'ascocarpes frais, la reprise peut également être entravée par Dactylium spp. (synonyme de Cladobotryum spp. et de Hypomyces spp., dure vie dans la nomenclature pour les moisissures...), alias Cobweb pour les ricains, un ascomycète mangeurs d'ascomycètes (entre autres).

Je vais présenter maintenant l'isolement sur deux milieux : la gélose glucose / pomme de terre (ou milieu PDA pour Potato Dextrose Agar), qui est le milieu semi-synthétique classique utilisé pour l'isolement du mycélium de champignons filamenteux, et la gélose à l'extrait de terre (milieu SEA pour Soil Extract Agar), qui est un milieu assez méconnu du microbiologiste moyen, totalement naturel et indéfini, destiné à cultiver les organismes du sol les plus délicats (ce que semble être le mycélium de morille). Ce dernier milieu permettra de comprendre sous quelle forme le mycélium de morille passe l'été dans la nature et de répondre plus généralement à la question suivante : les morilles peuvent-elles manger de la terre ?

Fabrication du milieu PDA : faire cuire des pommes de terre épluchées dans un excès d'eau pendant 45 minutes à 100°C. Filtrer le bouillon ainsi obtenu et ajouter 20 g/L d'agar, 20 g/L de glucose et 1g/L de carbonate de calcium (ajout personnel). L'ajout de carbonate de calcium permet d'avoir une réserve de calcium et un milieu au pouvoir tampon élevé. Cuire 10 minutes à feu doux jusqu'à dissolution de l'agar. Verser en boites de pétri puis stériliser au moins 1 heure à 120°C (2 heures c'est mieux).

Fabrication du milieu SEA : faire cuire 1 kg de bonne terre de jardin avec une cuillère à soupe de cendres dans un large excès d'eau pendant 2 heures à 100°C. Cette opération doit être réalisée en extérieur à cause de l'odeur très forte dégagée. Récupérer un maximum de bouillon. Filtrer sommairement le bouillon ainsi obtenu puis laisser décanter une nuit. Récupérer le surnageant et ajouter 20 g/L d'agar, et 1g/L de carbonate de calcium (ajout personnel). Cuire 10 minutes à feu doux jusqu'à dissolution de l'agar. Verser en boites de pétri puis stériliser au moins 1 heure à 120°C (2 heures c'est mieux).

Je précise à tout hasard pour les gitanos en herbe qui me lisent qu'une heure à 120°C c'est pas une heure dans le minifour Rowenta de maman au milieu des macaron, c'est 120°C avec 2 bars de vapeur saturée dans la gueule ! C'est minimum cocotte minute à fond, idéalement autoclave industrielle avec cycle automatique ! Rangez aussi vos cuiseurs vapeur, couscoussiers, vitaliseurs de carottes et autres confituriers, ça va pas le faire non plus.

Les boîtes de pétri peuvent être remplacées par des petits bocaux à vis ou des tubes de culture que l'on inclinera pendant la stérilisation afin d'avoir une surface de culture plus importante. Le défaut principal des bocaux et tubes inclinés est que de l'eau liquide s'accumule toujours en bas du milieu de culture, facilitant les contaminations bactériennes. Je préfère donc de très loin les cultures en boîtes de pétri. Dans le cas ou des bocaux inclinés ou tubes de culture sont utilisés, on veillera à ne surtout pas visser le couvercle à fond (on le pose juste) : en plus des risques d'explosion pendant la stérilisation, la remise à l'air à température ambiante se fait avec un appel d'air suffisamment violent pour ruiner la stérilisation. Il est possible de fermer les bocaux simplement avec une feuille de papier d'aluminium bien ajustée pour éviter ces désagréments.

Lors de la stérilisation, il est important de laisser refroidir la cocotte minute ou l'autoclave complètement et dans un milieu le plus stagnant possible pour éviter de contaminer l'intérieur des boites avec des poussières dès que la température sera inférieure à 100°C. Cette étape de refroidissement dans une zone exempte de poussière est très importante. Une bonne pratique consiste à lancer le soir un cycle de stérilisation et à tout ouvrir le lendemain.

Une fois l'autoclave ou la cocotte refroidie, on constate à l'ouverture que les couvercles sont recouverts d'humidité. Il ne faut surtout pas manipuler les boîtes de pétri dans cet état sous peine de risquer une contamination. La meilleure méthode que j'ai trouvé consiste à incliner légèrement la cocotte avant de l'ouvrir afin de faire couler les gouttes sur la gélose (dans un environnement encore stérile), puis de stocker les boîtes de pétri à plat sur un chiffon propre sans rien toucher pendant deux jours, le temps que les couvercles sèchent sur leurs faces interne et que la gélose boive l'eau excédentaire qui aurait pu couler en surface. Une règle d'or : eau liquide dans les milieux de culture = multiplication incontrôlable des bactéries. C'est valable également pour l'amplification sur blé que nous verrons ultérieurement.

Une fois les boîtes de pétri ou les bocaux et tubes inclinés bien secs à l'intérieur, on peut procéder à l'inoculation des milieux de culture par des petits morceaux d'hyménium sec découpés à l'aide d'un ciseau passé à la flamme ou dans l'eau bouillante. On peut travailler sur un papier absorbant, stérilisé de la même manière que les boîtes de pétri par exemple (bourré dans un bocal non fermé ayant subit le même procédé de stérilisation). Le travail se ensuite fait dans l'environnement immédiat d'une flamme de bec bunsen (20-30 cm autour de la flamme). L'effet de stérilité autour de la flamme est simplement du à la colonne d'air ascendante qui empêche la chute de particules non stériles sur les milieux de culture. Le port d'un masque chirurgical est utile si l'on doit parler en même temps, mais pas nécessaire si l'on prend soin de respirer doucement pendant l'opération. L'inoculation est réalisée en enfouissant un petit morceau d'hyménium sec dans la gélose en bord de boîte. L'inoculation en bord de boîte permet de récupérer le mycélium qui progresse le plus vite vers le bord opposé, le mycélium de morille ayant une croissance plus rapide que la plupart de ses compétiteurs. De manière générale, le milieu en boite de pétri ou en bocal reste stérile tant que le couvercle est posé dessus, on limitera donc au maximum la manipulation des couvercles (et des boîtes par extension). L'opération se faisant avec des fragments de morilles non stériles, une bonne moitié des cultures sera contaminée, c'est normal. La suite va donc consister à rapidement identifier des mycéliums à bon potentiel et à éliminer toute culture douteuse. Je propose certains critères de sélection pour le mycélium qui pour l'instant ne m'ont pas rendu riche. A vous d'expérimenter.

La reprise de la croissance par germination des spores est rapide : sur milieu SEA, les premiers hyphes sont visibles dès le lendemain. Sur milieu PDA, les premiers signes de croissance apparaissent au bout de 48 heures. On voit bien ici la distinction entre milieu semi-synthétique et naturel : le milieu SEA est parfaitement adapté à la germination rapide des spores. La culture sur les deux milieux montre ensuite une croissance à 1 cm par jour à 18°C. Les boîtes de pétri sont envahies en une semaine. Le milieu PDA a paradoxalement été plus sélectif (moins contaminé) que le milieu SEA pour le mycélium de morilles. En tout cas la culture répond à une question : les morilles mangent bien de la terre !

Comment reconnaître le mycélium de morille : le mycélium est initialement prostré et rampe rapidement à la surface de la gélose avec seulement quelques hyphes aériens visibles en lumière rasante. Sur milieu riche en sucre (PDA, gélose au jus de pommes, etc), la pigmentation du milieu de culture, puis du mycélium et des sclérotes est très précoce et intense. C'est une marque du mycélium : les milieux riches en sucres deviennent très foncés. Cette pigmentation intense est la conséquence indirecte d'un stress oxydatif, typiquement lié à la trop grande activité métabolique sur ces milieux riches en sucre facilement assimilables (rien n'est plus facilement assimilable que le glucose), couplée à un manque évident de micro-éléments pouvant être intégrés aux enzymes de protection contre les ROS (la pomme de terre n'est pas connue pour sa richesse légendaire en micro-éléments). On rappelle le rôle primordial du manganèse (par exemple) sur la protection des mitochondries, principale faiblesse des fungi, contre le stress oxydatif. C'est à mon avis la raison principale pour laquelle le mycélium de morille sur milieu PDA devient rapidement pigmenté s'il n'est pas conservé à basse température. Il est bon de noter que la création de sclérotes est d'après moi également très dépendante de la saison. Toute culture menée hors printemps ou automne donnera plutôt une culture encroûtante que des sclérotes bien individualisés sur milieu riche. C'est vraiment le brunissement précoce du milieu de culture, puis le roussissement du mycélium vers deux semaines de culture à 20°C qui est révélateur du mycélium de morille selon moi.

Inversement, sur milieu SEA, la teneur en carbone assimilable est faible et la disponibilité des micro-éléments fortes : le mycélium pousse vite (aussi vite que sur milieu PDA), mais sous une forme très peu dense et garde un caractère juvénile (pas de pigmentation, pas de sclérotes). C'est certainement sous cette forme juvénile que le mycélium passe l'été dans le sol, ce qui explique sa capacité à fructifier même après avoir subit des températures élevées. Le phénotype en milieu SEA reste ras quel que soit l'âge de la culture.

Dans tous les milieux de culture, le mycélium de morille se caractérise par la présence de nombreuses anastomoses (le croisement de deux hyphes génère un point de contact sur la gélose). Ce trait morphologique est absent de tous les contaminants potentiels rencontrés en boîte de pétri.

Etant donné les avantages et inconvénients de ces deux milieux de culture, je propose un troisième milieu de culture adapté spécifiquement pour la culture du mycélium de morille: une gélose à la terre enrichie avec une source de carbone moins stressante du point de vue osmotique (amidon) et surtout moins concurrentielle, ainsi qu'une source de vitamines et protéines reconnue : la levure (de bière ou de boulanger).

Fabrication du milieu SEA enrichi pour conservation du mycélium : autoclaver 1 kg de bonne terre de jardin avec une cuillère à soupe de cendres dans deux litres d'eau pendant 2 heures à 120°C. Récupérer un maximum de bouillon sans se soucier de sa turbidité et sans laisser décanter. Ajouter 20 g/L d'agar, 16 g/L d'amidon de maïs (maïzena), 16 g/L de levure de boulanger (ou de bière) séchée et 1g/L de carbonate de calcium. Cuire 10 minutes à feu doux jusqu'à dissolution complète de l'agar. Verser en boites de pétri puis stériliser au moins 1 heure à 120°C (2 heures c'est mieux).

La culture sur ce milieu présente des caractéristiques intermédiaires entre le milieu SEA et PDA (croissance soutenue et pigmentation modérée), mais surtout, l'absence de sucres libres inhibe efficacement la croissance concurrentielle des parasites de type pénicillium et des bactéries. Ce milieu est donc assez polyvalent : efficace à la fois pour l'isolement et assez nourrissant pour la conservation du mycélium à 4°C.

Quelle est l'étape finale du procédé ? On repique du mycélium bien pur prélevé à l'extrémité opposée du lieu d'inoculation, par découpage d'un bout de gélose de 5x5 mm à l'aide d'un scalpel passé à la flamme, sur une nouvelle gélose nutritive stérile puis on stocke le tout à basse température (4°C) en attendant l'étape suivante qui reprend à l'automne : l'amplification du mycélium sur blé. Comme l'isolement à partir de morilles séchées peut être réalisé à n'importe quelle époque de l'année, il est judicieux de le faire en fin d'été juste avant l'étape d'amplification pour éviter l'étape de stockage.

La conservation du mycélium de morille peut également être effectuée sur des simples bocaux de terre stérile (additionnée d'une source d'amidon par exemple). Les bocaux présentent l’intérêt d'être plus facilement conservés stériles et d'être moins soumis à la dessiccation.

Conclusion : il est certainement possible de retarder la sénescence du mycélium de morille en le conservant sur milieu pauvre en sucres et riche en micro-éléments, comme la gélose à l'extrait de terre, ou même tout simplement sur de la terre stérile. Inversement, les milieux riches en carbone et pauvres en micro-éléments induisent un stress oxydatif intense sur le mycélium qui accélère probablement sa sénescence, obligeant ces milieux à être réfrigérés pour une conservation long terme du mycélium. Je propose donc un milieu de culture intermédiaire, sans sucres libres, la gélose à l'extrait de terre enrichie, qui me donne parfaite satisfaction en culture. Dernier point : je refuse catégoriquement l'utilisation d'antibiotiques car mes cultures contaminées finissent au compost, qui finit lui-même dans mon potager. 

Edit avril 2021 : les photos de mycélium jaunâtre présentées dans cet article correspondent à du mycélium probablement contaminé par une bactérie. Des images de mycélium pur peuvent être consultées sur ce document. La méthode présentée ici n'est pas remise en cause pour autant.

Pour approfondir c'est par ici : l'isolement du mycélium de morilles pour les nuls en images

Mycélium de morille de 7 jours sur milieu PDA, vu en transparence. La pigmentation rousse intense du milieu de culture est typique de la morille sur milieu sucré. Crédit : Raphaël BOICHOT

Prochain article : Résumé de la thèse de doctorat de Ge Siyi, Penn State, 2019